Шляхи вдосконалення методу лікування ран пересадкою вирощених in vitro клітин шкіри

Метод відновлення шкірного покриву, запропонований Гріном і співавторами, постійно вдосконалюється [Garcia Fernandez E. et al., 1995]. Головним чином, це стосується технології культивування клітин. Метод має ряд недоліків, одним з яких є велика тривалість культивування клітин (18-24 діб. І більше), що обмежує можливості його застосування для лікування потерпілих. Іншим недоліком є ??висока складність технології пересадки клітин. Вирощені на поверхні культураль-них судин епітеліальні пласти необхідно за допомогою ферментативної обробки відокремити від поверхні і, закріпивши на спеціальному носії (парафінізірованной марлі), перенести на ранову поверхню. У результаті дії ферменту відбувається скорочення майдані вирощеного пласта, пошкоджуються клітини і міжклітинні зв'язки, що негативно на впливає приживлення епідермаль-них пластів. Після зняття шару з підкладки останній може деформуватися, його необхідно розправити і фіксувати на будь-якому носії. Для підвищення механічної міцності він повинен бути багатошаровим, а це неминуче збільшує тривалість культивування кератиноцитів. Навіть невеликі відхилення в технології ферментної обробки зводять нанівець всю раніше проведену роботу.

УДОСКОНАЛЕННЯ ПРОЦЕДУРИ зняття та перенесення КЛІТИННОГО ПЛАСТУ З поверхні культурального Судини на РАНИ

Зберегти життєздатність кератиноцитів на цьому етапі можна двома способами. Перший передбачає відпрацювання рецептур, що дозволяють открепляют клітинні пласти без пошкодження клітин. Другий напрямок - це виключення самої процедури ферментної обробки за рахунок застосування підкладок, на яких можна культивувати і трансплантувати на рани МПК. V. Ronfard і співавт. (1991) в якості підкладки для вирощування кератиноцитів використовували фібринові гель. Після формування пластів гель з клітинами виймали з чашок Петрі і переносили на ранові поверхні. Незважаючи на те, що харчування базальних клітин було трохи утруднено, через 10-15 днів після трансплантації формувався стратифікований епідерміс. Цей спосіб останнім часом стали використовувати широко [Rives J., Carsin H., 1995].

Н. Kaizer і співавт. (1994) трансплантували аутологічних кера-тіноціти на поверхні фібринового матриксу і поверх них накладали розщеплені клапті аллокожі, консервованої в гліцерині. Таким чином ними були закриті рани на площі від 3 до 15% поверхні тіла. Якість відновленої шкіри було цілком задовільним. Відомі й інші варіанти пластики. J. Корр і співавт. (1995) суспензію кератиноцитів у фібринової клеї переносили на рани і поверх клітинної культури накладали перфоровану (але не розтягнуту) алогенну шкіру.

Для перенесення на рани клітин можливий і інший підхід. При цьому на поверхні пленківиращівается один шар кератиноцитів (або фібробластів), який в положенні головою вниз-пересідає на поверхню ран. У наших дослідженнях ми використовуємо плівку Фолідерм, на поверхні якої добре відбувається проліферація клітин (див. рис. 7.19 і 7.20). Після аплікації на рану плівка захищає пересаджені клітини від висихання і від інфекції. Живий еквівалент шкіри (ЖЕК), запропонований Е. Bell і співавт.

(1983) до цих пір не знайшов широкого клінічного застосування для лікування обпечених. Це пов'язано з тим, що отримання живого еквівалента шкіри є ще більш складною технологією.

Для виключення етапу ферментної обробки і полегшення процедури трансплантації клітинної культури на ранові ложе нами був запропонований метод культивування кератиноцитів на поверхні мікроносіях, опис якого наводиться нижче.

КУЛЬТИВУВАННЯ І ТРАНСПЛАНТАЦІЯ кератиноцитів і ФІБРОБЛАСТІВ НА ПОВЕРХНІ мікроносіях

Кератиноцити і фібробласти відносяться до клітин, життєздатність яких залежить від субстрату (anchorage-dependent cells). Щоб проліферіровать, їм необхідно прикріпитися до поверхні підкладки.

Як було зазначено вище, для лікування великих опіків існує необхідність нарощування великий клітинної маси. Вирощування кератиноцитів на плоскій підкладці не дозволяє вирішити це завдання в повному обсязі. Більш технологічним є вирощування клітин на мікроносіях (МН), що представляють собою дрібні частинки, до яких прикріплюються клітини, і які можуть перебувати в живильному середовищі в зваженому стані.

На думку S. Reuveny (1985), переваги цього методу полягають в наступному:

При вирощуванні на МН досягається більш високий рівень відношення площі поверхні субстрату, до якого прикріплюються клітини, до обсягу культурального судини. Збільшити це співвідношення можна простим зміною концентрації мікроносіях у флаконі. Існує можливість виростити до 9 млн клітин в 1 мл живильного середовища.

Зростання клітин може здійснюватися в одній посудині (високопродуктивному) замість кількох малопродуктивних, що істотно знижує вартість культивування.

Створюються кращі умови для моніторингового контролю за станом середовища в культуральному посудині (рН, РС02 і т. д.), що дозволяє досягати більш відтворюваних результатів.

Існує можливість взяття невеликих проб клітинного матеріалу для дослідження.

Процедура зняття клітинного матеріалу полегшується.

Стає можливим здійснювати трансплантацію клітин на поверхні МН без ферментної обробки.

Існує принципова можливість культивувати клітини в промислових масштабах.

В даний час розроблені численні види мікроносіях, які застосовуються в біотехнології (Biocarrier; Cytodex-1, Cytodex-2, Cytodex-3; Superbeads, Ventragel; Geliibeads; Biosilon; Cytospheres; DE-53 та ін.) Мікроносіях можуть бути пустопорожніми (зі скла), мати щільний або пористий матрикс, а також поверхневий шар (покриття) з різних біологічно активних матеріалів (желатин, колаген, Ламінін, фібронектину, полілізін та ін.)

Всі мікроносіях відрізняються за своїм складом, за типом покриття і за технологією отримання. Залежно від хімічного складу МН можуть мати різну консистенцію і електростатичний заряд поверхні. У кератиноцитів заряд негативний, і тому вони найкраще прикріплюються до мікроносіях, які мають позитивний заряд поверхні. На мікроносіях можна культивувати різні типи клітин. Разом з тим, до недавнього часу в науковій літературі відсутні дані про можливість культивування кератиноцитів на поверхні МН.

Нами, спільно зі співробітниками лабораторії з вивчення клітинної проліферації (НДІ біології розвитку, зав .- д-р біол. Наук В. В. терських), проведено дослідження з визначення можливості вирощування кератиноцитів на поверхні МН, в результаті яких встановлено, що для культивування клітин шкіри серед доступних видів мікроносіях найкраще підходять мікроносіях Цітолар і Цітопол (рис. 7.25). Культивування КЦ здійснювали в середовищі, склад якої ідентичний такої, використовуваної для вирощування їх на плоскому субстраті. Принципова схема методу наведена на рис. 7.26.

Необхідно також зазначити, що крім кератиноцитів на поверхні МН може культивуватися і інші види клітин, наприклад, фібробласти. Мікроносіях з прикріпленими до них клітинами переносять на поверхню ран. Потім клітини (кератиноцити або фібробласти) сповзають з МН і проліферують на ранах.

При аналізі характеру росту клітин на поверхні МН встановили наступне. Кератиноцити мають різну ступінь рас-пластанності та місцями формують багатошарові конгломерати (рис. 7.27). При цьому периферична частина кератиноцитів сильно розпластується, а на ній знаходяться КЦ з верхнього ряду, які в свою чергу розпластуються і своєю периферичної частиною сповзають на поверхню мікроносіях. Таким чином формується багатошарова структура.

Цікаво, що в культурі, що не досягла конфлюентності, міжклітинні зв'язку слабкі. У досліджуваних пробах відсутні зрілі десмосоми і полудесмосомами, зустрічаються тільки формуються

структури. У кератиноцитах на МН були виявлені меланосоми, що свідчить про присутність у культурі пігментних клітин. Після трансплантації мікроносіях на рани клітини мігрують і проліферують, за рахунок чого відновлюється шкірний покрив. На рис. 7.28 показаний процес сповзання кератиноцитів на гель.

Згодом мікроносіях виштовхуються на поверхню або, в разі їх занурення в тканини ранового ложа, біодеградірующіе (рис. 7.29).

На мікроносіях також можна вирощувати фібробласти (рис. 7.30).

У процесі культивування кератиноцитів і фібробластів на поверхні мікроносіях частина клітин може відкріпити від поверхні підкладки. Ці клітини зберігають життєздатність і при попаданні на ранові ложі також можуть прикріплюватися до нього і про-ліферіровать.

Широке впровадження біотехнологічних методів лікування в клінічну практику можливе лише при наявності технології, які забезпечують отримання клітинної біомаси у великих обсягах і у відносно короткі терміни. В даний час цієї мети найбільшою мірою відповідають методи культивування клітин на поверхні мікроносіях і мембран.

У схематичному вигляді перспективні способи вирощування клітин в сучасних типах біореакторів представлені на рис. 7.31.

Таким чином, в даний час існують методичні підходи, позволяюшіе відійти від класичної технології лікування, запропонованої). Rheinwald, H. Green (1975,1979).

При лікуванні обпечених можуть використовуватися й інші біотехнологічні продукти (одержувані в штучних умовах ростові фактори, компоненти позаклітинного матриксу).