Головна/Лікування хвороб/Опіки


Технологія отримання дермального еквівалента складається з наступних етапів: виділення фібробластів зі шкіри, культивування клітин, приготування розчину колагену, змішування фібробластів з колагеном і ростової середовищем, подальше культивування ДЕ, трансплантація на рани. Для отримання ДЕ можна використовувати алогенних клітини різного походження (отримані від донорів шкіри, ембріональні фібробласти).

Принципова схема отримання цих складних клітинних композицій наведена на рис. 7.32.

Один з варіантів отримання дермального еквівалента. Фітобласти для отримання дермального еквівалента виділяють з різних джерел, одним з яких є шкіра. У цьому випадку у донора зрізають розщеплені клапті шкіри завтовшки 0,2-0,3 мм. Шматочки шкіри поміщають в транспортну середу (199, DMEM або іншу) з додаванням 5% ембріональної телячої сироватки та антибіотиків (гентаміцину) і доставляють у лабораторію, де буде проводитися культивування клітин. В умовах ламінарного боксу проби шкіри 2-3 рази промивають у розчині Хенкса, розрізають на тонкі смужки шириною 0,1-0,3 мм і поміщають в 0,25% розчин трипсину на 16-20 годин при температурі + 4 ° С. Після цього двічі промивають у розчині Хенкса і відокремлюють дерму від епідермісу. Отримані шматочки дерми поміщають між покривними скельцями в чашки

Технологія отримання дермального еквівалента і живого еквівалента шкіри

Петрі з середовищем DMEM, що містить 10% ембріональну телячу сироватку і антибіотик (гентаміцин). Чашки поміщають в термостатіруемий інкубатор з регульованою подачею двоокису вуглецю (5% об.) При температурі + 37 ° С і витримують протягом 6-8 діб. Зміну середовища здійснюють через 3 дні. Протягом цього часу відбувається виповзання фібробластів, які поступово заповнюють всю поверхню чашки.

Іншим важливим джерелом отримання фібробластів є ембріони. У наших дослідженнях ми використовували ембріональні людські фібробласти (ФЕЧ). Джерелом отримання ФЕЧ є абортивний матеріал - ембріони 8-12 тижнів. Безумовною вимогою є ретельне дотримання правил асептики при отриманні біологічного матеріалу. Як і у випадку з шкірою, шматочки ембріонів поміщають в транспортну середовище, що складається з DMEM з додаванням 5% ембріональної телячої сироватки та ген-таміціна, і доставляють в лабораторію в охолодженому стані (при температурі + 4 ... + 8 ° С). Шматочки ембріонів промивають у розчині Хенкса і переносять у пробірку з 0,25% розчином трипсину, яку на 16 год поміщають в холодильник при температурі + 4 ° С. Потім ці ж шматочки поміщають в свіжому 0,25% розчині трипсину на магнітну мішалку при + 37 ° С на 30 хв. Далі розведенням і 10-кратним перемішуванням в піпетці знову отримують суспензія клітин, після чого пропускають її через нейлонову марлю. Клітини осаджують центрифугуванням при 1000 оборотів в хвилину і далі засівають в культуральні флакони. Культивування проводять в ростової середовищі FAD (суміш середовищ DMEM і F12 в співвідношенні 1:1) з 10% сироватки великої рогатої худоби. Чашки Петрі з культурою поміщають в інкубатор з дозованою подачею вуглекислоти і витримують при температурі + 37 ° С протягом 6-8 діб. Контроль за станом культури здійснюють за допомогою спостереження в інвертований мікроскоп, зміну середовища проводять через кожні 2-3 дні.

Зняття клітин з підкладки для виконання наступного етапу (отримання ДЕ) здійснюють двома способами: обробкою 0,125% розчином трипсину або ж за допомогою гумового скребка. Підрахунок клітин здійснюють в камері Горяєва за загальноприйнятою методикою з використанням вітального барвника (трипановий синього). Після цього фібробласти або пересівають для збільшення клітинної біомаси, або використовують їх для отримання ДЕ. У процесі культивування контроль за станом культури здійснювали за допомогою спостереження в інвертований мікроскоп.

Підготовка ран і виразок трофігескіх до пересадки ДЕ проводиться за тими ж принципами, що і для трансплантації багатошарових пластів кератиноцитів. Обов'язковою умовою є придушення Везі-тірующей в ранах патогенної мікрофлори, видалення залишків відмерлих тканин.

Технологія отримання дермального еквівалента і живого еквівалента шкіри

 

Незважаючи на відносну простоту технології отримання та пересадки ДЕ на ранові поверхні, метод досі не знайшов широкого клінічного застосування. Основним недоліком технології одержання ДЕ є те, що через контракції гелю в процесі дозрівання він сильно зменшується в розмірах. Для запобігання контракції F. Auger і співавт. (1990) запропонували закріплювати кільце із пластику навколо ДЕ (або ЖЕК) на чашці Петрі. При цьому зберігається початковий розмір ДЕ і зменшується його товщина, що сприяє приживлення клітинної культури.

Іноді при транспортуванні на великі відстані через трясіння дермальний еквівалент руйнується, що ускладнює процедуру його перенесення на рани. У цих випадках можна використовувати наступний підхід. Культивування ФБ проводять на поверхні мікроносіях і на їх же поверхні транспортують в клініку. Безпосередньо перед трансплантацією формують гель і додають в нього мікроносіях з клітинами.

Після пересадки на ранові поверхні ФБ мігрують з МН в гель і функціонують в ньому так само, як і в класичному варіанті дермального еквівалента. На рис. 7.33-7.35 чітко видно, що фібробласти мігрують в гель, фагоцитируют і переробляють його, відкладаючи в навколишнє середовище колагенові волокна.

Вирощування і застосування живого еквівалента шкіри для лікування ран. Ця композиція складається з двох частин дермальній складової (ДЕ) і вирощеного на її поверхні епітелію. Для лікування ран раціонально використовувати живий еквівалент шкіри (ЖЕК), вирощений з аутологічних клітин. Допускається використання алогенних фібробластів тільки для отримання дермальній складової, епітеліальну ж частина ЖЕК повинні складати кератиноцити, виділені зі шкіри того ж пацієнта.

Відповідно мають місце деякі відмінності в технології отримання ЖЕК порівняно з ДЕ. Далі наведено один із можливих варіантів одержання ЖЕК, при якому Дермальная складова була підготовлена ??заздалегідь.

Дермальний еквівалент отримують змішуванням ростової середовища (зокрема - DMEM), розчину колагену і суспензії фібробластів. До 1 мл розчину колагену (3,3 мг / мл) додають 0,15 мл 10-кратної середовища 199 і 0,048 мл 0,34 м розчину NaOH і поміщають суміш у термостат при температурі + 37 ° С на 20 хв. Далі додають 1 мл (3000 клітин) суспензії фібробластів людини в ростової середовищі DMEM і розливають по чашках Петрі. Чашки Петрі встановлюють в термостат з поданням вуглекислоти (5% об.) При температурі + 37 ° С і витримували протягом 7-9 діб.

Технологія отримання дермального еквівалента і живого еквівалента шкіри

Для отримання ЖЕК необхідно виділити епітеліальні клітини. Шматочки шкіри доставляють у лабораторію в транспортному середовищі того ж складу (див. вище). В умовах ламінарного боксу проби шкіри 2-3 рази промивають у розчині Хенкса, розрізають на тонкі смужки шириною ОД-0, 3 мм і поміщають в 0,25% трипсину (Gibco) на 16-20 годин при температурі + 4 ° С. Після цього двічі промивають у розчині Хенкса і відокремлюють дерму від епідермісу. Після відділення епідермісу від дерми шматочки епідермісу поміщають в пробірку з сумішшю фосфатного буферного розчину (PBS) і 0,25% розчину трипсину в співвідношенні 1:1 і поміщають на термостатують-ющую гойдалку з частотою 40 коливань на хвилину при температурі + 37 ° С на 12 хв. Далі для зупинки дії ферменту додають сироватку великої рогатої худоби з розрахунку 5% від загального обсягу і витримують протягом 10-15 хв. при кімнатній температурі. Пробірку з епідермісом 10 разів сильно струшують, отриманий розчин відбирають піпеткою з відбитим носиком і фільтрують через лійку з нейлоновим фільтром в іншу пробірку. Суспензія клітин центрифугують протягом 5 хв. при 1000 об / хв. Суперна-танто зливають, осад розводять ростової середовищем, диспергируют і засівають (500 000 клітин на чашку діаметром 35 мм) на підготовлений-ний дермальний еквівалент. Підрахунок життєздатних клітин проводять за допомогою фарбування проби вітальним барвником

трипановий синій в камері Горяєва. Ростова середовище складається з суміші середовищ DMEM і F12 у відношенні 3:1 з додаванням 10% сироватки великої рогатої худоби, гентаміцину, інсуліну, гідрокортизону холерного токсину; аденіну, трансферину, ліотіроніна. Через 2-і доби при зміні середовища в неї додають епідермальний фактор росту. Велике значення має якість використовуваних компонентів, зокрема, колагену. Найбільш доцільно при отриманні ДЕ і ЖЕК використовувати нативний колаген зі збереженими телопепті-дами. Така технологія була розроблена Л. В. Кухаревой, що лягло в основу нового способу отримання складних клітинних композицій та їх застосування для лікування ран (подана заявка на винахід).

Технологія отримання дермального еквівалента і живого еквівалента шкіри

У ході реалізації способу змішування клітин (фібробластів) з ростової середовищем і розчином колагену, а також транспортування проводиться в діапазоні температур від 0 до + 10 ° С. Отримана суміш на холоді залишається рідкою, але при нанесенні на рану при температурі тіла полімеризується в гель. Таким чином виходить тонкий дермальний еквівалент. На наступному етапі (при необхідності) поверх нього накладається клітинна культура кератиноцитів, вирощених на поверхні покриття Фолідерм, в цьому випадку виходить живий еквівалент шкіри.

Вирощування ЖЕК має свої особливості. При виготовленні дермальній складової доцільно до складу гелю вносити крім колагену еластин і глікозаміноглікани, т. к. диференціювання епідермісу в цьому випадку відбувається краще і раніше формується базальна мембрана. Формування багатошарового стратифікованого епідермісу відбувається швидше, якщо пласти кератиноцитів знаходяться на кордоні з повітряним середовищем.

ЖЕК досить добре моделює структуру і основні функції шкіри (рис. 7.36) і в зв'язку з цим його можна використовувати для вивчення впливу на шкіру різного роду хімічних агентів. Крім того, культивування складних тривимірних клітинних композицій дозволяє вивчати процеси репарації і диференціювання, що є надзвичайно необхідним при проведенні медико-біологічних досліджень.

Через високої складності технології одержання живого еквівалента шкіри цей метод не знайшов широкого застосування в клініці. Разом з тим, безперечною перевагою ЖЕК є те, що в результаті приживлення ЖЕК формується повноцінна в морфо-функціональному відношенні шкіра.