Трансплантація вирощених епітеліальних пластів на ранові поверхні

Трансплантація вирощених епідермальних пластів є одним з найбільш складних і відповідальних етапів технології лікування, від правильного виконання якої часто залежать результати лікування.

Підготовку пластів кератиноцитів до трансплантації проводять в окремому чистому приміщенні з дотриманням правил асептики. При відсутності спеціального приміщення для роботи з клітинними культурами допустимо працювати в умовах операційної. Для того, щоб здійснити трансплантацію клітин, необхідно мати наступне оснащення:

термостат, встановлений на температуру + 37 ° С;

ламінарний бокс;

пристрій для випалювання по дереву типу Візерунок або ін;

парафінізірованние марлеві покриття типу Sofra-tulle, Tulle-grass або подібні;

спиртівку;

очні пінцети;

шпателі.

Бажано проводити всі маніпуляції з клітинної культурою в ламінарному боксі. При наявності певних навичок можна працювати і без ламінарного боксу. Термостат має бути розміщений поблизу - в цьому ж або сусідньому приміщенні. Термостат має бути ретельно відрегульований, оскільки навіть незначне перегрівання в умовах впливу діспази істотно знижує життєздатність кератиноцитів.

Для того щоб здійснити пересадку клітин, необхідно на першому етапі добитися відкріплення пласта від поверхні культураль-ного флакона.

Відкріплення багатошарового пласта кератиноцитів від поверхні культурального флакона. Багатошаровий клітинний шар кератиноцитів людини являє собою тонку прозору плівку, надзвичайно чутливу до зовнішніх впливів (фізичним та хімічним). Відкріплення пласта від поверхні підкладки проводять обробкою діспазой, що володіє здатністю вибірково порушувати дермоепідермальние зв'язку. При дії на багатошаровий пласт діспаза переважно руйнує зв'язок клітин базального шару з підкладкою і в істотно меншій мірі впливає на міжклітинні зв'язку, що робить можливим знімати пласт цілком. Необхідно відзначити, що відкріплення пласта походить від периферії до центру і тому тривалість дії ферменту на різні ділянки клітинної культури буде різною. Відповідно можна очікувати, що ступінь впливу на клітини діспази в різних ділянках пласта буде неоднаковою.

Процедура ферментної обробки не є безболісною для клітин. Надмірне дію діспази порушує міжклітинні зв'язку (десмосоми), в результаті чого клітинний шар може повністю зруйнуватися (рис. 7.11. Іноді надмірна дія діспази призводить до пошкодження клітин без руйнування цілісності пласта. Пересадка такої культури також приречена на невдачу (рис. 7.12.

Таким чином, однією з причин невдач при трансплантації багатошарових пластів кератиноцитів є похибка при проведенні ферментної обробки. Відбувається це в наступних випадках:

при використанні більш концентрованих розчинів ферменту, ніж це необхідно;

при надмірно тривалої інкубації пласта з ензимом;

при температурі в термостаті, що перевищує оптимальну. Послідовність дій при знятті багатошар ного пласта кератиноцитів з поверхні культурального флакона:

Транспортне середовище зливається, пласти кератиноцитів тричі промиваються розчином Хенкса або живильним середовищем, що містить антибіотики, зокрема - гентаміцин (0,2 мг / мл).

У флакони заливають 0,125% розчин діспази (Sigma) і поміщають в термостат, де інкубують при температурі 37 ° С протягом 20-30 хв. За цей час слід кілька разів перевірити стан пласта у флаконі. Ознакою того, що діспаза подіяла і пласт можна знімати, є наявність бахроми по краях, що коливається при погойдуванні флакона з боку в бік. Такий

пласт не можна довго тримати в термостаті, надмірне дію дис-пази може привести до зниження життєздатності клітин.

Розчин діспази зливають, епітеліальні пласти 2-3 рази промивають розчином Хенкса або середовищем.

Нагрітим над полум'ям пальника скальпелем або приладом для випалювання типу Візерунок зрізають кришку пластикового культурального флакона так, щоб був забезпечений вільний доступ до епідер-ному пласту.

На поверхню епідермального шару накладають вирізаний за розміром клапоть парафінізірованной марлі типу Paranett, TYille-grass, Sofra-tulle або їм подібні.

Очними пінцетами захоплюють краю відкріпивши пласта кератиноцитів і загинають їх на верхню поверхню парафінізірованной марлі (рис. 7.13. Краї парафінізірованного покриття підводять і його вивертають. При цьому пласт відривається від підкладки і натягується на парафінізірованное покриття. Одночасно шпателем підсовує від'єднатися від поверхні культурального флакона пласт. Пласт в цей момент дуже легко пошкодити, тому всі маніпуляції повинні здійснюватися обережно.

Відкріплень пласт на поверхні парафінізірованного покриття переносять в чисту чашку Петрі з середовищем або розміщують в тому ж розрізаному культуральному флаконі в положенні клітинами вгору.

Пересадка клітинної культури на рани. Після відкріплення пласта кератиноцитів від підкладки необхідно по-можливості швидко здійснити пересадку культури на рани. Це пов'язано з наступними обставинами:

не має міцного зв'язку з підкладкою клітинний шар зменшується на 10-15% від початкових розмірів;

клітинна культура в цей момент схильна висихання і тому її необхідно змочувати культуральної середовищем.

На результати трансплантації великий вплив робить використання того чи іншого типу ранових покриттів. Відомо дослідження N. Carver і співавт. (1993), які в досвіді на свинях оцінювали вплив ранових покриттів різного типу на приживлення багатошарових пластів кератиноцитів. При цьому автори встановили, що при закритті пластів кератиноцитів пересаджені на рани пов'язками з плетеної віскози клітини приживаються найгірше. Це було пов'язано з тим, що через таке покриття відбувалося інтенсивне випаровування рідини з поверхні рани, і клітини гинули. Крім того, при знятті пов'язок частина клітин віддалялася разом з марлею. При використанні парафінізірованних сітчастих пов'язок,

створюють напівзакрите оточення, МПК нахлібників добре, висихання клітин не відбувалося. Пвдрогелевие пов'язки створювали закрите оточення, при їх використанні випаровування відсутнє взагалі. Завдяки оклюзії виключалася адгезія кератиноцит-тов до пов'язкам і при знятті останніх втрата клітин не відбувалася. Тому оклюзія найкраще сприяє прикріпленню до рани та виживання кератиноцитів на рані. Проте для формування стратифікованого епідермісу необхідно повітряне оточення. Це досягається видаленням на 7-10-а доба парафінізірованной (або гідрогелевими) пов'язок і подальшим веденням ран з МПК під сухими пов'язками або ж у присутності невеликої кількості водорозчинних мазей.

Таким чином, пересаджені пласти кератиноцитів повинні бути прикриті шаром парафінізірованной марлі, що створює напівзакрите оточення, поверх якої накладають 3-6 шарів стерильних серветок.