Відбір біоптатів шкіри для виділення і подальшого культивування кератиноцитів

Найпершим етапом є відбір і транспортування шматочків шкіри від хворих для подальшого вирощування клітинних пластів.

Шматочки шкіри для вирощування клітин можна зрізати різними способами (скальпелем, дерматомах, ножем Тірша) під загальною і місцевою анестезією.

Обробка шкіри перед відбором клаптів шкіри. Одним з необхідних умов успішного здійснення технології є відсутність мікробної забрудненості шматочків шкіри, взятих для виділення з них клітин. Тому, слід ретельно обробляти ділянку, з якої планується зрізати біоптат. Для цього цілком досить ретельно промити обрану ділянку мильним розчином або поверхнево-активними речовинами (шампунями, миючими порошками). Допускається використання розчинів йодопірона, Сульйодопирон або їх аналогів, за умови, що перед зрізанням шкіри залишки цих речовин будуть видалені. Після цього шкіру слід

2-3 рази обробити бензином і 2-3 рази протерти 70-90% спиртом. Для обробки шкіри замість бензину можна також використовувати діетиловий ефір.

Знеболювання. У нашій практиці найчастіше зрізання шкіри виробляли під місцевою анестезією інфільтраційної 0,25-0,5% розчином новокаїну і рідше - під час операцій або перев'язок під наркозом. В результаті проведеного аналізу зроблено висновок, що використання різних видів знеболювання істотно не впливає на життєздатність виділених кератиноцитів. Однак на цей рахунок існують і інші думки. Зокрема, на думку М. Tazio, I. Zitelli (1995) зрізання шкірних клаптів під місцевою анестезією сумішшю лідокаїну і адреналіну призводить до зниження життєздатності клітин. У значно меншій мірі на вітальні функції клітин надає анестезія, проведена одним тільки лідок-іншому.

Товщина зрізаного шкірного клаптя. Життєздатність виділяються з шматочків шкіри кератиноцитів в певній мірі залежить від товщини зрізаних клаптів шкіри. Це пов'язано з особливостями технології виділення клітин зі шкіри, а саме, з необ-ходмостью проведення ферментної обробки. У зв'язку з тим, що тонкі розщеплені клапті шкіри (товщиною 0,2-0,3 мм) краще просочуються ферментом, що більш товсті і, тим більше, повно-шарові, виділення клітин з них відбувається швидше. Зменшення тривалості процедури тріпсінізаціі знижує небезпеку надмірної дії ферменту і сприятливо позначається на життєздатності кератиноцитів.

Таким чином, при відборі шкірних клаптів для вирощування клітин шкіри слід прагнути зрізати тонкі шкірні клапті товщиною не більше 0,2-0,3 мм.

У які терміни найкраще зрізати шкірні клапті для виділення і подальшого вирощування клітин. У процесі відпрацювання методу було встановлено, що кератиноцити зі шкіри важко-обпалених проліферують в культурі значно гірше, ніж клітини, взяті від здорових донорів. Представляється можливим навіть говорити про наявність певного зв'язку між тяжкістю травми і ступенем погіршення проліферативних властивостей клітин. В ході проведених досліджень було встановлено, що найкраще виділення і подальше культивування клітин відбувалося у випадку, якщо біоптати шкіри були взяті протягом першої доби після отримання травми. Кератиноцити, виділені зі шкіри обпалених у періоді токсемії, володіли меншою життєздатністю і протоку-фератівной активністю. Мабуть, здатність клітин шкіри рости в культурі багато в чому залежить від загального стану організму в момент відбору проб шкіри [терських В. В., Васильєв А. В., 1995]. Можна припустити, що метаболічні порушення, характерні для опікової хвороби, проявляються на рівні кожної окремо взятої клітини організму, що негативно позначається і на процесі культивування кератиноцитів. З цієї причини біоптати шкіри краще всього відбирати в перші години після травми або безпосередньо після виходу потерпілого зі стану опікового шоку. Відбір проб шкіри у донорів для отримання алогенної культури клітин здійснюється за тими ж правилами, що і при використанні аутологічних кератиноцитів. Життєздатні клітини можна виділити (і культивувати) навіть зі шкіри трупа, за умови відбору біоптату через невеликі проміжки часу (не пізніше 6 годин) після настання смерті і при зберіганні трупа на холоді.